La famiglia BCL-2

Ruolo delle proteine BCL-2 nello switch apoptotico¹

L’apoptosi, un tipo di morte cellulare programmata, è fondamentale per lo sviluppo degli organismi pluricellulari e per assicurare una sana omeostasi tissutale.2 Nei mammiferi, l’esecuzione di questa via è controllata da due programmi molecolari che in ultima battuta portano all’attivazione di membri selezionati della famiglia delle caspasi. Successivamente ne deriva il clivaggio di substrati cellulari chiave, portando alla morte cellulare. I due programmi molecolari sono noti come la via estrinseca, che opera a valle dei recettori di morte, come Fas e la famiglia del recettore del fattore di necrosi tumorale, e la via intrinseca, attivata da una gamma variegata di segnali di stress. L’identificazione del citocromo c come fattore apoptogenico rilasciato dai mitocondri ha segnato una svolta cruciale nella scoperta dell’importanza di questi organelli nella via intrinseca dell’apoptosi. Il “punto di non ritorno” in questa via è definito dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP, mitochondial outer membrane permeabilization), che porta al rilascio del citocromo c.³

La via intrinseca (mitocondriale) dell’apoptosi è controllata dalla famiglia delle proteine BCL-2, che operano all’interno di una complessa rete di interazioni proteina-proteina e proteina-membrana.² La famiglia di proteine BCL-2 regola la MOMP e perciò determina il commitment cellulare verso l’apoptosi.³ Infatti, le proteine BCL-2 giocano un ruolo fondamentale nel mediare il delicato equilibrio tra la sopravvivenza e la morte della cellula (Figura 1). La distruzione di questo equilibrio da parte di alterazioni cellulari che aumentano l’attività funzionale delle proteine anti-apoptotiche rispetto alle proteine pro-apoptotiche può permettere l’evasione dell’apoptosi, che sposta l’equilibrio a favore della sopravvivenza cellulare e quindi promuove lo sviluppo e la progressione dei tumori.¹

Figura 1. L’equilibrio tra le proteine anti-apoptotiche e pro-apoptotiche. Tratto da Fig. 2B, ref. 1.

LA FAMIGLIA DI PROTEINE BCL-2¹

Ci sono almeno 20 proteine simili a BCL-2 nelle cellule mammifere.⁴ La famiglia BCL-2 include regolatori sia pro- sia anti-apototici della via intrinseca dell’apoptosi.¹ La famiglia può essere suddivisa in tre gruppi principali a seconda delle regioni di omologia con BCL-2 (domini BH, BCL-2 homology) e della funzione (Figura 2):

• Proteine multidominio anti-apoptotiche → BCL-2, BCL-XL, BCL-w, MCL-1, BFL-1/A1
• Proteine multidominio pro-apototiche → BAX, BAK
• Proteine BH3-only pro-apototiche → BID, BIM, BAD, BIK, NOXA, PUMA, PMF, HRK.5

Figura 2. Le tre sottofamiglie delle proteine BCL-2. Tratto da Fig. 1, ref. 4.

BCL-2 e i suoi parenti più prossimi, BCL-XL e BCL-w, proteggono la cellula da una vasta gamma di stimoli citotossici, come la deprivazione citochinica, l’irraggiamento con raggi UV o γ e i farmaci chemioterapici. Anche le proteine A1 e MCL-1 proteggono la cellula dagli stimoli citotossici. Altri parenti di BCL-2, per lo più identificati come proteine che legano BCL-2, promuovono l’apoptosi piuttosto che contrastarla.⁴

Struttura tridimensionale delle proteine BCL-2⁶

Considerando sia l’omologia strutturale sia quella di sequenza, è oramai chiaro che i sei membri pro-sopravvivenza – la stessa BCL-2, BCL-X_L, BCL-w (nota anche come BCL2L2), MCL-1, A1 (nota anche come BFL-1 nell’uomo) e BCL-B (nota anche come BCL2L10) – così come gli effettori pro-apoptotici BAX, BAK e BOK condividono quattro domini BH e adottano strutture globulari simili: un fascio di strutture a elica circondato da un’elica centrale idrofobica (α5). Questa piega genera un solco superficiale idrofobico delineato dalle α-eliche 2, 3, 4 e 5. Questo solco costituisce un’interfaccia essenziale per le interazioni con il dominio BH3 dei membri pro-apoptotici della famiglia BCL-2, come BIM.

Queste interazioni avvengono principalmente sulle membrane intracellulari, e in particolare sulla membrana mitocondriale esterna, alla quale sono ancorati molti membri della famiglia BCL-2 mediante un dominio transmembrana carbossi-terminale idrofobico (Figura 3).⁶

Figura 3. La struttura 3D della famiglia BCL-2. Tratto da Fig. 2B e 2C, ref. 6.

Al contrario dei membri della famiglia BCL-2 con multidomini BH globulari, la maggioranza delle proteine BH3-only sono intrinsecamente disordinate, anche se le loro regioni BH3 diventano un’elica anfipatica all’interazione con i loro partner proteici. BID, che collega il pathway mediato dai recettori di morte a quello mitocondriale per amplificare la cascata delle caspasi, rappresenta l’eccezione strutturale. La sua struttura assomiglia a quella dei membri multidominio, i cui residui chiave del dominio BH3 sono nascosti e quindi inattivi. Il clivaggio di BID, ad opera per esempio della caspasi-8, genera la forma troncata attiva (tBID), in cui il dominio BH3 è esposto. È possibile che sotto certe circostanze BID intatto possa comportarsi in modo simile a BAX o BAK.⁶

Localizzazione subcellulare delle proteine BCL-2¹

Mentre il dominio transmembrana C-terminale è comune alla maggior parte delle proteine BCL-2 multidominio, la localizzazione subcellulare di queste proteine varia nelle cellule sane. Per esempio, relativamente alle proteine multidominio pro-apoptotiche ben studiate BAK e BAX, BAX è prevalentemente citosolica e viene traslocata ai mitocondri durante l’induzione dell’apoptosi, mentre BAK è una proteina integrale di membrana localizzata nei mitocondri e nel reticolo endoplasmatico.¹ 

Esistono anche differenze nella localizzazione delle proteine multidominio anti-apoptotiche:

• BCL-2, che è costitutivamente legata alla membrana, con la coda C-terminale ancorata alla membrana e i residui rimanenti nel citosol, è localizzata nei mitocondri e nel reticolo endoplasmatico;
• BCL-X_L, BCL-w e MCL-1 non sono legate saldamente alle membrane e perciò possono essere localizzate, almeno in parte, nel citosol delle cellule sane e traslocare nei mitocondri durante l’apoptosi.¹

LA FAMIGLIA BCL-2: REGOLATORI DELLA VIA INTRINSECA MITOCONDRIALE⁵

Diversi stimoli citotossici, tra cui lo stress oncogenico e gli agenti chemioterapici, così come i segnali di sviluppo, coinvolgono la via mitocondriale, che è regolata dai membri della famiglia BCL-2 (Figura 4). Questi stimoli attivano le proteine BH3-only (iniziatrici), che inibiscono le proteine BCL-2 pro-sopravvivenza (guardiani), permettendo così l’attivazione degli effettori pro-apoptotici BAX e BAK, che in seguito perturbano la membrana mitocondriale esterna. Il citocromo c rilasciato dai mitocondri promuove l’attivazione della caspasi-9 sulla proteina scaffold Apaf-1, mentre la proteina rilasciata SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases) blocca l’inibitore delle caspasi XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein).⁶

Figura 4. Le vie dell’apoptosi. Tratto da Fig. 1, ref. 6

INTERAZIONI TRA I MEMBRI DELLA FAMIGLIA BCL-26

Le proteine BH3-only, che sono indotte trascrizionalmente o post-traduzionalmente da segnali di stress citotossici, esercitano la loro funzione pro-apoptotica mediante due meccanismi:

• Neutralizzazione delle proteine BCL-2 pro-sopravvivenza
• Attivazione diretta degli effettori pro-apoptotici BAX e BAK.⁶

Neutralizzazione delle proteine BCL-2 pro-sopravvivenza⁶

La neutralizzazione delle proteine pro-sopravvivenza è stata ben caratterizzata, sia strutturalmente sia funzionalmente, e queste informazioni hanno guidato lo sviluppo di nuove terapie mirate a queste proteine. L’elica anfipatica BH3 delle proteine BH3-only lega il solco idrofobico delle proteine pro-apoptotiche principalmente mediante l’inserzione di quattro residui (h1-h4) lungo un lato nelle tasche idrofobiche del solco, e mediante la formazione di un ponte salino tra un residuo BH3 conservato di aspartato (Asp) e un residuo conservato di arginina (Arg) nel dominio BH1 delle proteine pro-sopravvivenza (Figura 5).⁶

Figura 5. Inserzione dell’elica anfipatica delle proteine BH3-only nel solco idrofobico delle proteine anti-apoptotiche. Tratto da Fig. 2D, ref. 6.

A causa di alcune lievi differenze strutturali nei domini BH3 e nel solco idrofobico delle proteine pro-sopravvivenza, alcune proteine BH3-only (come BAD e NOXA) sono selettive solo per alcune delle loro compagne pro-sopravvivenza, mentre altre proteine BH3-only (in particolare BIM, tBID e PUMA) probabilmente neutralizzano tutte le proteine pro-sopravvivenza (Figura 6).⁶

Figura 6. Selettività delle interazioni delle proteine BH3-only. Tratto da Fig. 2E, ref. 6

Per quanto riguarda invece la selettività delle proteine anti-apoptotiche, è interessante notare come studi strutturali abbiano mostrato come il solco che lega il dominio BH3 delle proteine BCL-2 pro-sopravvivenza abbia una notevole plasticità, che probabilmente contribuisce alla loro abilità di legarsi a molteplici domini BH3 distinti. Infatti, BAK è inibito soprattutto da BCL-X_L, MCL-1 e A1, anche se BCL-2 può contribuire in alcuni contesti, mentre BAX probabilmente può essere inibito da tutte le proteine pro-sopravvivenza (Figura 7).⁶

Figura 7. Selettività delle interazioni delle proteine BCL-2 anti apoptotiche. Tratto da Fig. 2F, ref. 6.

Attivazione di BAX e BAK⁶

Sono stati descritti tre modelli per spiegare come le interazioni tra i membri della famiglia BCL-2 controllano lo switch apoptotico (Figura 8).⁶

Nell’attivazione diretta, alcune proteine BH3-only, in particolare tBID, BIM e forse PUMA, coinvolgono e attivano direttamente gli effettori pro-apoptotici BAX e BAK. Le proteine BH3-only prive di questa funzione “attivatrice” diretta, come BAD, sono dette “sensibilizzatori” per indicare che coinvolgono esclusivamente i membri pro-sopravvivenza della famiglia BCL-2, rilasciando così le proteine BH3-only attivatrici (Figura 8A).⁶

Mentre le proteine pro-sopravvivenza, come BCL-2, sequestrano principalmente le proteine BH3-only per attivazione diretta, nel modello di attivazione indiretta le proteine pro-sopravvivenza devono anche sequestrare qualsiasi molecola di BAK o BAX che viene attivata ed espone il suo dominio BH3 (Figura 8B). Secondo questo modello, BAK e BAX potrebbero essere attivati in molteplici modi, come per una modifica sconosciuta o spontaneamente ad una bassa velocità.⁶

Il consenso attuale è che entrambi i modelli trovino applicazione in molte circostanze. Perciò, un modello unificato richiede che le proteine pro-sopravvivenza sequestrino non solo le proteine BH3-only (modo 1) ma anche attivando BAX e BAK (modo 2) (Figura 8C).⁶

Figura 8. Modelli di controllo dello switch apoptotico. Tratto da Box 1, ref. 6.

In una cellula sana, sia BCL-X_L sia MCL-1 possono legarsi a BAK, presumibilmente in una conformazione “pronta” con il dominio BH3 esposto. L’apoptosi viene indotta se e solo se le proteine BH3-only spostano BAK da entrambi questi guardiani pro-sopravvivenza. BAK, in questo modo libero e pronto, può formare un nucleo di oligomeri di BAK (di struttura ignota) che provoca la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e il rilascio del citocromo c (Figura 9A). BAX sembra essere regolata in modo analogo, ma la maggior parte delle molecole di BAX “non pronte” sono citosoliche, e tutte le proteine pro-sopravvivenza sembrano poter inibire l’attivazione di BAX (Figura 9B).⁷

Figura 9. Modello di regolazione di BAK e BAX da parte delle proteine pro-sopravvivenza. Tratto da Fig. 4, ref. 7.

DEREGOLAZIONE DELLO SWITCH APOPTOTICO DELLE PROTEINE BCL-2 NELL’ONCOGENESI⁷

La caratterizzazione iniziale e gli studi successivi dei distinti membri della famiglia BCL-2 hanno fornito una prima indicazione che la loro funzione è correlata al cancro.³ Difatti, BCL2 è stato il primo regolatore mammifero dell’apoptosi ad essere stato identificato, scoperto come parte della traslocazione cromosomica reciproca t(14;18) comunemente riscontrata nei linfomi umani a cellule B, come il linfoma follicolare.²

Cellule trasdotte con il gene BCL2 rimanevano vitali per periodi estesi in assenza di fattori di crescita. Topi transgenici portatori del minigene BCL2-Ig che replicava la traslocazione cromosomica t(14;18) mostravano un’iperplasia follicolare a cellule B che nel tempo progrediva a linfoma diffuso a grandi cellule B. L’espressione di BCL-2 blocca in modo specifico le caratteristiche morfologiche dell’apoptosi, incluso il blebbing della membrana plasmatica, la condensazione del nucleo e il clivaggio del DNA. Studi successivi hanno mostrato che l’espressione di BCL-2 è richiesta per il mantenimento tumorale. Soprattutto, con la scoperta di BCL-2, è emersa una nuova categoria di oncogeni, che a differenza degli altri oncogeni noti al tempo, non promuovono la proliferazione ma piuttosto bloccano attivamente l’apoptosi.³

Alterazioni nell’espressione di altre proteine BCL-2 sono state riportate nel cancro. Mutazioni nella regione codificante di BAX sono osservate in circa il 50% dei tumori colorettali e gastrici. Inoltre, sono state identificate mutazioni somatiche missense nei geni BAD e BIK rispettivamente nel tumore del colon e nei linfomi periferici a cellule B. La perdita di eterozigosi per BIM nel linfoma mantellare e di HRK nel glioblastoma sono solo alcuni esempi che suggeriscono che i membri pro-apoptotici della famiglia BCL-2 possano fungere da oncosopressori. Risultati inaspettati hanno inoltre suggerito che oltre a regolare l’apoptosi, proteine BCL-2 selezionate possono avere funzioni alternative in altre vie omeostatiche, tra cui il metabolismo del glucosio, i check-point del ciclo cellulare a valle del danno genomico e la regolazione della morfologia mitocondriale.3